前沿显微成像技术专题——转盘式共聚焦显微镜

传统的荧光显微技术在生物成像领域有两个难以克服的挑战：一是对生物样品的结构做3D成像。在传统宽场荧光显微镜中，照明光会照亮光路上的整个样品，来自非焦平面的杂散光信号也会被成像物镜收集到（图1），干扰所要观察的的样品信号，不但降低横向分辨率，轴向分辨率也只能达到2.5µm左右，比大多数生物结构都要大，因此很难对样品3D结构清晰而准确地成像；另一个挑战是对样品内部结构清晰成像。在观察细胞内部活动时，细胞膜的荧光信号会对成像产生大的干扰

                图1 小鼠肾脏切片（厚度20µm）分别在 (a) 宽场和 (b) 荧光共聚焦显微镜下的成像效果。

               哺乳动物上皮细胞（厚度50µm）分别在 (c) 宽场和 (d) 荧光共聚焦显微镜的成像效果。Scale bar: 20µm。

如何排除这些来自非焦平面的干扰信号呢？早在1953年，美国学者马文·明斯基就提出了“共聚焦”的构想。经过30年的发展，这一想法逐渐成为今天非常成熟的共聚焦显微成像技术。“共聚焦”的原理就是在样品的共轭焦平面上添加一个带有“针孔”的挡板（图2）通过针孔阻断杂散光，提高分辨率和对比度。共聚焦显微镜具有较好的光学切片能力，轴向分辨率可提高到500 nm左右。

图2 共聚焦原理示意：位于共轭平面上的针孔阻挡了来自样品上方 (a) 和下方 (b) 的杂散光，只有来自焦平面的光才能通过针孔进入探测器（c）。

传统的激光扫描共聚焦显微镜使用逐点扫描，用光电倍增管（PMT）作为检测器，虽然成像清晰，但是速度比较慢。而且PMT的光电转换效率也比较低，需要较强的激发光。这就导致这种技术的光漂白和光损伤非常大，不适用于活细胞成像。

为了对活细胞进行快速成像，我们本期专题的主角——转盘式共聚焦显微镜闪亮登场了。

图3 带有阿基米德螺旋状针孔的Nipkow Petran转盘Nipkow Petran转盘。针孔直径为d，间距为s。

转盘式共聚焦显微镜的原理是在物镜像平面上放置一个 Nipkow 转盘，转盘上分布着排列成阿基米德螺旋的针孔（图3），激光光源覆盖所有针孔的范围（即扫描区域），每当转盘旋转30°，一个针孔就扫描图像上对应的一块区域，以此来实现对样品的完整扫描。与传统的点扫描方式相比，这种多点同步扫描方式不仅大大提高了采集速度，也意味着可以使用面阵相机（背照式sCMOS或EMCCD）取代PMT，提高量子效率，从而降低激发光功率，大大降低了对样品的光漂白和光损伤。转盘共聚焦模块通常是独立的，可以加在显微镜的相机端口（图4）。图像亮度、对比度和光学切片质量都可以通过优化转盘性能得到改善。

           图4 Yokogawa CSU-X1转盘共聚焦装置示意。该装置包括电动旋转针孔盘和微透镜盘，可安装在显微镜的摄像机端口上。

与激光扫描共聚焦相比，转盘式共聚焦具有高速，高灵敏度，易于安装等优点，更适合研究活细胞及其内部动态过程。

入射光通过转盘的比率称为透射率T，可用如下公式计算:

D：针孔直径；S：针孔间隔距离。

针孔直径决定了穿过针孔的光的多少——较大的针孔可以让更多的光通过；而间隔距离决定了较长尺度上的阻断杂散光的能力。离焦平面足够远的杂散光会进入相邻的针孔，这一过程称为针孔串扰（Pinhole cross-talk）。串扰的程度取决于样品，样品越厚影响越大。增加间隔距离可以降低串扰，但代价是减少光的。

当我们带入典型值D=25μm和S=250μm，可以得到透射率仅为1%，说明绝大多数光（主要是杂散光）都可以被阻挡。然而，激发光强和相机灵敏度仍然是决定图像质量的关键。

转盘照明光的透射率可以通过微透镜进行提高。图5为Yokogawa公司设计的转盘装置，它由两个同轴排列的圆盘组成，每个圆盘包含大约20000个针孔。上圆盘在下圆盘每一个针孔对应的位置都装有微透镜，将入射光直接聚焦在下圆盘的针孔上，再照射到样品上。通过添加微透镜盘，可以将透射率提高一个数量级（Inoue and Inoue 2002），进一步降低了激发光强度。

图5：微透镜圆盘通过主圆盘的针孔聚焦照明光。发射光被分色镜分离进入相机（Graf, Rietdorf and Zimmermann 2005）。

针孔直径是转盘式共聚焦系统的一个重要参数。针孔过大会降低轴向分辨率。针孔过小又会导致照明光过度衍射和过度阻挡发射光，降低图像对比度。通常来说，转盘针孔直径都会由制造商针对60倍或100倍油镜进行优化。对于给定物镜的系统来说，有三个关键参数决定了针孔直径（Dopt）：