经常会有一些分析人员犯一些低级的错误，出现问题便不知所措，而这些操作错误却常常在药典标准操作规范中均有描述，因此如果想成为分析方面的高手，更应该把药典及其标准操作规范两本工具书，反复的研读，不同的工作阶段都需要研读，熟能生巧。接下来咱们就着重说说含量测定的液相色谱方法学验证操作过程要点吧。
方法学验证操作注解——含量测定液相色谱法方法验证
方法摸索优化
目标优化梯度条件，确定分析波长。
1、 样品溶剂选择；
2、 滤膜吸附试验；
3、 DAD检测器下，波长选择主成分较大吸收或平台处。
4、 分离条件选择；
5、 色谱柱对比；（根据情况酌定）
6、DAD检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料（制剂研究时需同时进行空白辅料破坏）等成分分离。
1、 一般在无参考标准或标准的方法无法直接套用时,需进行此项研究内容，如3类药。
2、样品溶剂：对样品有很好的溶解能力，实验室自然放置稳定存放12小时以上，与流动相有良好的互溶效果。
3、续滤液峰面积达稳定较大值，续滤液体积在5ml以下时较为适宜，否则需要重新筛选溶剂。
4、破坏程度10%左右（5%—15%）为宜，2mol/l酸或碱90℃水浴12小时无破坏即视为样品稳定，不必再追求降解度。4500lx光照48小时，样品粉末及溶液需要同时做。破坏后的样品溶液及空白溶剂均需调整至流动相pH方可进样，可避免对色谱柱产生不良影响。如果破坏超过20%，需要降低破坏条件。
5、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。
6、梯度变化要有较高洗脱能力过程，目的证明所有的杂质成分均能够被洗脱检测。
7、方法摸索优化实验一般是不上资料的，只是体现在实验记录本中，除非是没有方法依据时，如3类药申报时，梯度选择及波长选择等均需要在资料中体现。
8、方法优化完成后，在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。
9、方法摸索优化实验采用工艺已经确定的实验室小试、实验室放大样品进行，前期用于原料合成样品配合检测时，可以采用大范围的梯度洗脱进行模糊检测分析。
专属性
目的为了验证方法对目标成分检测的区分能力及详细的杂质分析评价。
DAD检测器或适宜的通用型检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料，各杂质对照品等在同一天进行分析，可以作为申报资料中杂质谱的论述内容。
1、参照上述过程进行破坏样品制备，空白及阴性样品都要做。
2、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。
3、梯度要有较高洗脱能力过程。
4、以前期确定的分析条件及方法，在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。
5、本部分数据进资料，采用生产线验证的第1批样品进行。
当色谱条件与有关物质检查方法相同时，专属性实验数据可以共用。
出图时主成分峰的紫外光谱图及峰纯度图均要出图。
检测限
信噪比法，S/N≥3倍时的浓度为检测限。
空白，再进对照品浓溶液（1mg/ml），在主峰相同位置处选择空白溶剂1—2min范围的基线积分得出峰高，按照峰高的3倍计算样品浓度，直接用浓溶液稀释至目标浓度附近即可，资料中体现至少3张图（空白溶剂、浓溶液、及稀释液）。
定量限
信噪比法，S/N≥10倍时的浓度为定量限。
按照基线峰高的10倍计算样品浓度，直接用检测限浓溶液稀释至目标浓度附近即可，连续进样6针，计算峰面积RSD<2%（可以放宽至5%），。与检测限在同一天做，出图时纵轴标尺与检测限一致，减少审评员审图时的信息误导，提高审图效率。
线性与范围
5点或7点法，酌情设置。
第一个点在定量限浓度，中间点为100%浓度一个点为200%浓度（160%或180%），采用稀释法，不得采用调整进样量的方式。r>0.999。
采用对照品进行。
线性范围一定要将回收率试验的较高浓度包含进去，否则回收率浓度超过线性范围，缺乏定量依据，这个错误非常常见。
准确度
同一份供试品（样品）溶液，连续进6次。
计算峰面积RSD<2%，资料中体现7张图（1张空白，6张样品液）。
进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。
溶液稳定性
与准确度在同一天穿插进行，实验前进行良好的排序设置，能共用的图尽量共用减少工作量。以下时间点必做（除非已知稳定性情况可减少时间点）。
0、4、6、8、10、12、18、24。
实验过程中可取准确度中的图作为2h或4h，甚至6h。
溶液稳定性数据至少做到16h稳定（尽量做得更长时间，都是自动进样，一个过夜就至少在12小时以上，时间太短无法证明溶液稳定性），极特殊情况下可以采用低温进样器或特殊的保存方法或现配现分析等操作，但要求有数据作为支持依据，方可将特殊处理方法定入标准。
6个数据计算峰面积RSD<2%。
重复性
同一批号样品，同一人员同法操作分别称取2份对照品及6份供试品（样品）溶液，各进1次。
计算含量RSD<2%，资料中体现9张图（1张空白，2张对照，6张样品）。
进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。
中间准确度
同一批号样品，不同人员，不同设备，同法操作，分别称取2份对照品及6份供试品（样品）溶液，各进1次。推荐次日操作，避免产生压针的疑问（万一审评老师没有注意到设备编号，所以别自找麻烦，推荐次日操作）。对照品也要重新称取。
与重复性的6个数据，共同参与统计，计算12个含量数据结果，RSD<2%，资料中体现18张图，其中重复性9张，次日数据9张（1张空白，2张对照，6张样品）。进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。
准确度
采用回收率试验方式进行，通常采用直接回收率实验法，按照80%、100%、120%比例分别称取样品，同法操作，每个比例各3份样品，各进1次。
以中间准确度的含量均值作为理论含量，计算回收率，回收率变动范围98%—102%，回收率RSD<2%，资料中体现12张图（1张空白，2张对照，9张样品）。进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。
原料药采用直接回收率。
制剂采用加样回收率测定：
采用20片或粒制剂单位终产品混合研碎后，按比例称取进行加样回收，加样回收率采用80%、100%、120%比例，1:1加入，加样回收率不能达标时（辅料有吸附或干扰较大时），方可采用直接回收率。回收率变动范围98%—102%，回收率RSD<2%，资料中体现12张图（1张空白，2张对照，9张样品）。
耐用性实验
改变色谱柱
不同品牌的色谱柱，共3个品牌。比较分离度，保留时间，含量测定结果。
如果品牌不足3个可采用多个批号或不同品牌多个批号的方式，不能采用废柱子进行实验。
在同一天对俩份样品溶液和俩份对照溶液进行。
3个品牌的色谱柱共15张图（每个色谱柱1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。
流动相比例
流动相的低组分比例变化约±5%。
在同一天对俩份样品溶液和俩份对照溶液进行。
3个不同比例的流动相15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。
流速变化
流速±10%。
在同一天对俩份样品溶液和俩份对照溶液进行。
3个不同流速的流动相15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。
不同pHpH值±0.2
在同一天对俩份样品溶液和两份对照溶液进行。
3个不同pH的流动相15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。
柱温柱温±5℃
在同一天对俩份样品溶液和一份对照溶液进行。
3个不同温度15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。进资料的图谱采用生产线验证的第1批样品进行。标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。
0天样品检测
方法学研究结束且各项考察数据符合要求后，对3批生产线验证样品及被仿品在同一天进行检测。此数据在申报资料产品检验报告单中体现，且可作为稳定性的0天数据。
双样双针。对照品也为双样双针。

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