高效液相色谱仪（HPLC）作为精准分析检测的核心设备，广泛应用于医药、食品、环境监测等领域，其操作规范性直接影响分析结果的准确性、重复性，以及仪器的使用寿命。在实际操作中，若忽视细节或违反操作规程，易引发柱效下降、检测器故障、数据失真等问题。以下从四个核心环节，梳理高效液相色谱仪必须避免的错误操作方式，为实验操作提供科学指引。
一、流动相处理：忽视纯化与脱气，埋下系统隐患
流动相作为 HPLC 分析的 “载体”，其纯度、脱气效果直接影响色谱柱性能与检测精度，常见错误操作集中在以下两点：
错误 1：直接使用未经过滤的流动相。部分操作人员为节省时间，将未经过 0.22μm（或 0.45μm）滤膜过滤的甲醇、乙腈或缓冲液直接倒入溶剂瓶。流动相中可能含有的微小颗粒（如试剂杂质、尘埃）会随流动相进入色谱柱，堵塞柱内填料孔隙，导致柱压骤升、柱效快速下降，甚至造成色谱柱损坏；同时，颗粒还可能污染进样阀与检测器流通池，影响仪器正常运行。正确做法是：所有流动相（包括水相、有机相、缓冲液）均需通过对应孔径的滤膜过滤，且水相、有机相需使用不同滤膜（水相用亲水膜，有机相用疏水膜），避免滤膜溶解污染流动相。
错误 2：流动相未脱气。若直接使用未脱气的流动相，其中溶解的氧气、氮气等气体在色谱柱中因压力变化会释放气泡，气泡进入检测器后会导致基线剧烈波动、出现尖锐杂峰，严重时会中断流动相输送，造成分析数据失真；此外，溶解氧还可能与流动相中的有机相（如甲醇）或样品发生反应，影响检测结果准确性。正确做法是：采用超声脱气（一般超声 15-20 分钟）、在线脱气或真空脱气等方式，尤其在使用缓冲液或混合流动相时，需延长脱气时间，避免气泡残留。
二、样品准备：预处理不当，导致分析结果失真
样品预处理是 HPLC 分析的关键前序步骤，错误操作会直接影响分离效果与定量准确性：
错误 1：样品未过滤或过滤不规范。若将含有悬浮颗粒、絮状物的样品直接进样，颗粒会堵塞进样针、进样阀，甚至随样品进入色谱柱，与流动相中的杂质共同加剧柱污染；同时，颗粒在检测器中会产生假信号，导致色谱峰形拖尾、基线漂移，无法准确判断样品组分。正确做法是：使用 0.22μm（与流动相滤膜孔径一致）的针式滤头对样品进行过滤，过滤时需弃去初始几滴滤液，避免滤头污染样品；对于粘稠度较高的样品，需先进行稀释或离心处理，再进行过滤。
错误 2：样品溶剂与流动相不兼容。部分操作人员为方便，使用与流动相极性差异过大的溶剂溶解样品（如用纯甲醇溶解需用磷酸盐缓冲液 - 乙腈作为流动相的样品），会导致样品进入色谱柱后因溶剂与流动相混合不均，出现 “溶剂效应”—— 表现为色谱峰分裂、峰形不对称、保留时间漂移，严重时会影响组分分离度，无法准确定量。正确做法是：选择与流动相初始比例（或极性相近）的溶剂溶解样品，若样品在流动相中溶解度较低，可适当提高有机相比例，但需确保溶剂与流动相混合后无分层、无沉淀。
三、仪器操作：参数设置与操作流程错误，损伤仪器部件
仪器操作环节的不规范，不仅影响分析效率，还可能对色谱柱、检测器等核心部件造成不可逆损伤：
错误 1：开机后直接升压，未进行系统排气。开机后若未先开启泵进行低流速（如 0.2-0.5mL/min）排气，直接将流速升至分析流速并升压，会导致系统内残留的气泡被压缩在管路或色谱柱中，形成 “气塞”，造成柱压异常升高；同时，突然升压会对色谱柱填料产生冲击，导致填料颗粒塌陷，缩短色谱柱使用寿命。正确做法是：开机后先将泵流速调至 0.5mL/min，打开排液阀（或断开色谱柱入口端），待流出液无气泡后，关闭排液阀（或连接色谱柱），再逐步升高流速至分析条件，避免流速骤升骤降。
错误 2：分析结束后未及时冲洗系统与色谱柱。实验结束后若直接关机，流动相中残留的缓冲液（如磷酸盐、醋酸盐）会在色谱柱内干燥结晶，堵塞填料孔隙；同时，缓冲液与有机相混合后若长时间停留，可能产生沉淀，污染进样阀与检测器流通池；对于反相色谱柱，若未用纯有机相（如甲醇、乙腈）封存，柱内残留的水相会导致填料水解，降低柱效。正确做法是：分析结束后，先使用不含缓冲盐的流动相（如甲醇 - 水）冲洗系统 20-30 分钟，再用纯有机相冲洗色谱柱 30 分钟以上（确保柱内无缓冲盐残留），最后关闭泵与检测器，待柱温降至室温后关机。
错误 3：检测器操作不当，影响检测精度。常见错误包括：紫外检测器未进行基线校正即开始分析，导致基线漂移影响峰面积积分；荧光检测器未开启氙灯预热，直接进行检测，导致光源强度不稳定，出现荧光信号波动；检测器流通池污染后未及时清洗，残留的样品或流动相在流通池内吸附，导致检测灵敏度下降，出现假阴性结果。正确做法是：开机后需对检测器进行基线校正（紫外检测器需预热 30 分钟以上），荧光检测器需提前开启氙灯预热 1 小时；实验结束后，需用合适的溶剂（如甲醇、乙腈）冲洗流通池，若流通池污染严重，可使用稀硝酸（针对金属离子污染）或超声清洗（需拆卸流通池，按仪器说明书操作）。
四、维护保养：长期忽视维护，缩短仪器使用寿命
高效液相色谱仪的定期维护是保障其稳定运行的基础，忽视维护易导致仪器故障频发：
错误 1：长期不更换进样针与密封圈。进样针长期使用后，针尖易磨损或变形，导致进样体积不准确，出现定量重复性差；进样阀密封圈长期受流动相腐蚀、样品摩擦，会出现密封不严，导致流动相泄漏、进样交叉污染（前一样品残留影响后一样品分析）。正确做法是：每使用 500-1000 次进样针后，检查针尖状态，若出现磨损及时更换；进样阀密封圈每使用 3-6 个月（或出现泄漏时）更换，更换时需注意密封圈型号与安装方向，避免安装错误导致密封失效。
错误 2：色谱柱储存与使用不当。将不同类型的色谱柱（如反相柱、正相柱）混合储存，未标注使用记录，易导致色谱柱误用（如用反相柱分析正相样品）；色谱柱长期不用时，未按要求用专用溶剂封存（如正相柱用正己烷 - 异丙醇封存），导致柱内填料干裂或受潮；使用时随意改变色谱柱温度范围（如超过色谱柱标注的最高温度），导致填料性能退化，柱效下降。正确做法是：色谱柱储存时需标注型号、使用时间、上次分析样品类型，按极性或类型分类存放；长期不用时，用对应的封存溶剂冲洗后密封两端，存放于阴凉干燥处；使用时严格遵守色谱柱的温度、pH 范围要求，避免超范围使用。
总之，高效液相色谱仪的操作需严格遵循 “预处理规范、参数设置精准、维护及时” 的原则，避免上述错误操作。只有规范操作流程，才能保障分析结果的准确性与可靠性，延长仪器使用寿命，为实验研究与质量检测提供有力支撑。
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